光化学系 II における O2 形成中の中間体の構造的証拠

Jun 12, 2023

Oteman、Svegea、Windmoller & Holscher Machinery、Rosenthal、ALS、Kashif Saeed General Trading、HR (Paper) Machinery Private、Orion Graphic Machinery、RK ラベル印刷機械、Hariram Engineering、KM Trivedi Engineering、CMC Converting Machinery Cevenini、Ghezzi & Annoni、クエン・ユー機械エンジニアリング

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Apr 13, 2023

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メトリクスの詳細

自然の光合成では、光によって水が電子、陽子、酸素分子に分解され、太陽エネルギーから化学エネルギーへの変換プロセスの最初のステップが形成されます。この反応は光化学系 II で起こり、Mn4CaO5 クラスターはまず 4 つの酸化当量、Kok サイクルの S0 から S4 中間状態を蓄積し、反応中心での光化学電荷分離によって順次生成され、次に O-O 結合形成化学を触媒します。 2、3。今回我々は、連続フェムト秒X線結晶構造解析による室温スナップショットを報告し、Kokの光合成水酸化サイクルの最終反応ステップ、つまりO2が形成されKokの水酸化時計がリセットされるS3→[S4]→S0遷移についての構造的洞察を提供する。。私たちのデータは、Mn4CaO5 クラスター、その配位子、水経路の変化、および Cl1 チャネルの水素結合ネットワークを介した制御されたプロトン放出を含む、マイクロ秒からミリ秒にわたって起こる一連の複雑なイベントを明らかにしています。重要なことは、S2→S3 転移中に Ca と Mn1 間の架橋配位子として導入された余分な O 原子 Ox が、3 回目のフラッシュ後の約 700 μs から始まる Yz 還元と並行して消失または再配置されることです。 Mn1 と Mn4 の距離の短縮によって示されるように、O2 発生の開始は約 1,200 μs で起こり、還元された中間体、おそらくは結合した過酸化物の存在を示しています。

X 線自由電子レーザー (XFEL)7 での連続フェムト秒 X 線結晶構造解析により、生理学的温度での反応の進行に応じて光化学系 II (PS II) の結晶構造解析データをリアルタイムで収集することができました。 PS IIの四光子誘起水酸化反応（図1a、b）は、複数の可視レーザーフラッシュによって開始されました。この機能を利用して、中間の S 状態構造 (S0、S1、S2、および S3) が研究されており 4、5、8、9、10 により、機能的な PS II の酸素発生複合体 (OEC) の構造変化が明らかになりました。 Mn4CaO5クラスターとその水-配位子環境で構成されるユニット（図1c、d）2、11。最近、我々は S2→S3 移行、つまり 1 つの基質水がクラスターに導入されるステップ中のいくつかの時点でスナップショットデータを収集しました。この研究 6 は、Mn の酸化のシーケンス、Mn1 と Ca の開放配位部位間の余分な酸素架橋 (Suga et al.10 の Ox または O6) の組み込み (S3 で Mn4CaO5-Ox を形成)、基質の潜在的な侵入経路であることを示唆しました。水とプロトンはゲート機構によって放出されます6,12。 XFEL 研究では、これらの測定によって得られた OEC の電子的および幾何学的構造が、使用された条件下では X 線光電子の影響を受けないことも明確に証明されました 6、8、13。

a、膜に埋め込まれたヘリックスとPS IIの内腔側の膜外部領域を有するPS IIの構造を灰色で示す。反応中心のクロロフィル (P680)、フェオフィチン、アクセプターキノン QA および QB、酸化還元活性チロシン Yz、触媒作用のある Mn4CaO5 クラスターなど、主要な電子伝達成分が色で示されています。 Yz および Mn4CaO5 クラスターは電子供与体部位の補因子です。 b、ドナーサイトで起こる水酸化反応のKokサイクル。PS IIのアンテナシステム内の光子（ナノ秒光フラッシュ、1F〜4F）の吸収によって引き起こされる反応中心P680の電荷分離によって順次駆動されます。室温の X 線結晶構造解析データは、S3→S0 遷移中に示された時点で収集されました。 c、d、S3 (c) および S0 (d) 状態の OEC の構造と、それらの間で発生するイベントのシーケンス。ん、紫。 Ca2+、緑色。ああ、赤い。 W1、-2、-3、-4 は Mn4 と Ca の水配位子です。水およびプロトン移動（O1、O4、および Cl1）に関連するチャネルは、それぞれ赤、青、緑の影付き領域として示されています。点線の円は、S3 状態と S0 状態の構造的な違いを示しています。

現在の研究では、コックの水酸化サイクルの酸素発生ステップ（図1b）、S3→[S4]→S0遷移（図1c、d）を調査します。暗順応した PS II サンプルでは、この移行は 3 回目の可視レーザーフラッシュによって開始されます。このステップでは、OEC は全 Mn(IV) S3 状態から、正式な酸化状態が Mn(IV)4O⦁ または Mn(IV)3(V) となる提案された高反応性 S4 状態に酸化されます。これにより、O-O 結合の形成と O2 の放出が開始され、空になった結合部位は新しい水基質によって満たされ、クラスターの最低の酸化状態 (S0) が形成されます。この多段階プロセスは 2 つのプロトンの放出も伴い、S 状態遷移の中で最も長い時定数を持ち、その反応速度は種とサンプル前処理に依存します 14、15、16、17、18、19。

この複雑な反応ステップ、特にMn4CaO5クラスターとそのタンパク質-水環境の間の重要な相互作用（図1c、d）についての構造的洞察を提供するために、S3中の7つの異なる時点でPS IIの室温結晶学的データを収集しました。 →S0 遷移。この遷移の開始後 50 μs から 4 ms の範囲です (図 1b)。すべてのデータセットの解像度は 2.00 ～ 2.16 Å (拡張データテーブル 1 および 2) です。

S3 状態は、暗順応した PS II 微結晶をその場で可視の 2 回のナノ秒レーザーフラッシュ (図 1b の 2F) で照射することによって生成されました (図 1b の 2F)。フラッシュ間の間隔は、アクセプターキノン QA および QB の反応速度を考慮して 200 ms でした。 S ステート遷移を効率的に駆動します。 S3状態とS0状態の間の時点は、結晶がフェムト秒XFELパルスにさらされる前に、さまざまな遅延時間（Δt）で3番目の可視ポンプレーザーフラッシュを与えることによって生成されました（図1bの時間ラベル）。私たちの照明プロトコルは、特定の S 状態の可能な限り高い集団を達成しますが、PS II 固有の非効率性 (「ミス」) に起因するフラッシュ数の増加により、S 状態集団の混合がより多くなります (方法) 20。私たちは、構造改良中にこの分布を多成分モデルでモデル化します。「主」成分は、S3 状態から S0 状態に進む中心になります。「二次」および「三次」成分は既知の開始点と終了点です。たとえば、S3 人口の減少と、遅延時間が長くなると、移行を完了したセンターからの S0 人口の増加が見られます (詳細は方法と拡張データの表 3 にあります)。）。各時点の主成分は、S3 と S0 の中間である複数の構造の混合物で構成されている可能性があることに注意してください。以下で議論するすべての結果は、モノマー I からのこれらの精製された主要成分に対応します (堆積構造では大文字で注釈が付けられている鎖)。

図 2 は、3 回目のフラッシュ後の時点 (Δt = 250、500、730、1,200、および 2,000 μs) での OEC とその周囲の精密化集団における選択された原子の省略マップ密度を示しています (3F の命名法を使用します( Δt μs))。 S3→[S4]→S0 遷移中の一連のイベントを視覚化するために、Yz と D1-H190 (図 2a、b)、Ox と O5 (図 2c) の 3 つの領域の変化を追跡します。水配位子W1〜W4（図2d）と、MnとCaの間を架橋するMn4CaO5/Mn4CaO5-Oxクラスターの2つのカルボン酸配位子（図2e）。さらに、初期（50 μs）と後期（4,000 μs）の時点データを含む、選択された原子距離の変化を図 3 に示します。

a、残基 D1-Y161 (Yz) および D1-H190。 S3 ステートリファレンスからの省略マップは、時点データ (青) と比較するために薄茶色で示されています。 b、Yz領域で観察された構造変化の簡略化した図。 c、OEC の原子 O5 および Ox の密度を省略します。 d, OEC の原子 O5 と末端水配位子 W1、W2、W3、W4 の密度を省略します。 e, D1-E189 および D1-D170 のカルボン酸酸素原子の密度を省略します。 a および c ～ e に示すすべての省略マップは、対象の原子または残基を個別に省略することによって生成され、主成分 (つまり、S0 に進む状態) のみが使用されました。注目すべき機能は、赤い矢印と黒い破線の円で強調表示されます。表示されているすべての省略マップは、視覚化を容易にするために d で注釈が付けられた配色を使用して 2.5σ、3σ、および 4σ で等高線が描かれています。補足情報ビデオ 1 も参照してください。

すべての距離は、各時点の洗練されたコンポーネント (つまり、S0 状態に進む状態) から取得されます。エラーバーは、「方法」で説明されているエンド/ラピッドアプローチから計算され、上限です。ここでのデータは平均値±標準偏差として表示されます。各時点のエラーバーは、n = 100 の独立した END/RAPID 改良から取得されました。 END/RAPID プロシージャの詳細については、「メソッド」を参照してください。右側の OEC の概略図の破線の矢印は、個々の距離の位置を示しています。 Mn は紫色の球として示され、O は赤い球として示されます。

Yz と D1-H190 の間の距離は、Yz6 の酸化状態の指標となることが以前に確立されています。還元状態では、Yz と D1-H190 間の強い水素結合により、距離は約 2.6 Å と短くなります。 P680+によるYzの酸化により、YzのフェノールプロトンがD1-H190に移動し、その距離は2.8Åに増加し、ヒス環面の動きが観察されます（図2b）。私たちのデータは、S3データと最初の時点（50μs）の間の距離がすでに増加していることを示しており、Yzがこの時点までに完全に酸化されていることを示しています（図3）。その後、この距離は 500 μs まで一定のままで、730 ～ 1,200 μs の間で基準レベルに戻ります。したがって、データは、Mn4CaO5-Ox クラスターによる \({{\rm{Y}}}_{{\rm{z}}}^{\mathrm{ox}}\) の減少が約 500 μs 後にのみ始まることを示しています。 (拡張データ表 4)16、21、22 であり、1,200 μs の時点までに完了しているように見えます。 Yz と His190 の間のさらなる距離の変化が 2,000 および 4,000 μs で観察されます。これは、最後のプロトン放出に関連する水素結合ネットワークの再配置によるものである可能性がありますが、現時点ではよく理解されていません。興味深いことに、光励起による特殊なChlペアの隣のTyr残基の位置の変化は、紫色細菌反応中心の時間分解結晶構造解析データで以前に注目されており、この反応中心の水素結合相互作用の変化に起因すると解釈された。脱プロトン化時のTyr23．

S3 状態に存在する余分な酸素 Ox は S0 形成時に失われ、Ox が O-O 結合形成に関与している可能性があり、その密度の変化がおそらくこのプロセスの開始を知らせる可能性があることを示しています。 Ox 集団を追跡するために、Ox は OEC モデルから除外され、その除外マップ密度が図 2c に示されています。 O5 は個別に省略され、それらの密度を比較できるようになりました (拡張データ図 1 も参照)。 Ox の欠落密度は 250 μs から非対称になり、500 μs 後に強度が明らかに減少し、1,200 ～ 2,000 μs の間のノイズレベルに低下します。Ox は 2,000 μs で 20% 未満の集団でのみモデル化できます。時点。 Ox 強度の変化は \({{\rm{Y}}}_{{\rm{z}}}^{\mathrm{ox}}\) の減少と同時に起こり、O-O 結合の形成が500μsと1,200μs。 S3→[S4]→S0 の遷移全体にわたって、1,200 μs での電子密度の減少を除いて、O5 密度はほぼ一定のままです。

クラスター内の Ox の存在を示す追加のマーカーは、Mn-Mn 距離です。以前に報告されたように、Mn1 - Mn4 の距離は、Ox の挿入により S2→S3 転移中に増加します (参考文献 6)。図 3 は、3F 構造では Mn1 – Mn4 距離が 1,200 μs まで伸長したままであり (Methods ではより詳細な分析が行われています)、その後、次の 3 ms にわたって減少して、S1 および S2 状態で見られたのと同じ値に達することを示しています。 Mn1-Mn3 距離でも同様の傾向が見られます。したがって、O-O結合形成の開始（YzとOxで観察された変化に基づくと500〜730μs）とMn-Mn距離が減少し始める時間（1,200μs）の間には遅延があります。この発見は、この期間中、O2 が放出される前に水の酸化中間体が存在する可能性が高いことを示しています。

水配位子W1〜W4の省略マップ密度の形状と強度の変化が観察され、図2dに表示されます。具体的には、250 μs で、O5 密度の W2 へのわずかな伸びと、W4 密度の W3 へのわずかな伸びが観察されます。この後者の傾向は継続し、500 μs で W3 と W4 の密度の重複が見られ、mFob − DFcalc ピーク (Fob と Fcalc はそれぞれ実験とモデルの構造係数、m と D は重み係数) が 2.5 にあります。 W3 と W4 の間の σ (拡張データ図 2)。同時に、W1 の密度は D1 ～ D61 および W19 に向かって広がり、W1 の移動度が高いことを示しています。これらの動きはすべて、OEC の脱プロトン化と Cl1 チャネルへのプロトン移動に関連していると推測されます (次のセクションと図 4 を参照)。

a, この地域の 5 つの水域 (W26 ～ W30) のグループを含む OEC 近くの O1 チャネルの終点。 0.8σ、1.0σ、および 1.5σ で等高線化された 2mFob − DFcalc 電子密度マップが重ねられています。 b. プロトンゲートとして機能することが示唆されている D1-D61 および D1-E65/D2-E312 領域を含む O4 および Cl1 チャネル (分岐 A)。オーバーレイされているのは、2.5σ、3.0σ、および 4.0σ で示されている W1、W2、および D61 の mFob − DFcalc 省略マップです。また、3σ での O4 チャネルの W19/W20/W48 の半径 1.5 Å 内の Fobs(時点) − Fobs(2F) 差分密度マップ (オレンジ色のマップ) も示します。特定の時点での E65 の側鎖で観察された回転角は、2F 状態での対応する側鎖の位置に関して計算されます。大きな変更点は矢印または破線の円で強調表示されます。すべての水は、図に示す分岐配色に従って、B 因子によって色付けされます。重要な水素結合相互作用は、強度を示す 2 値の配色で表示されます (距離 < 2.8 Å は赤、2.8 ～ 3.2 Å は灰色)。

730μsでは、O5、W2、およびW3の密度は異方性になり、すべてこれら3つの酸素原子の間の領域を指しています（図2d）。これは、これらのリガンドの移動度の増加を示しています。同時に、Ox 密度も異方性が高くなります。 4 つの酸素原子すべてのこの移動は、水の酸化中間体の形成に関連している可能性があります。牛の位置の正確なモデリングには、より高解像度のデータが必要であることに注意してください。 1,200 μs では、すべての末端水リガンド (W1 ～ W4) と架橋 O5 の密度が最も弱くなります。 OEC 内のこれらの省略マップ密度と、S3→S0 ステップでは顕著な役割を果たさないと考えられている O2 原子の密度とを比較すると、密度の減少がこれら 5 つの原子 (W1 ～ W4) に特有であることがわかります。および O5) および Ox (拡張データ図 1)。 O5、W2、および W3 の濃度の重なりは 1,200 μs で観察されなくなりました。

3 回目のフラッシュ後 2,000 μs では、O5 オットミマップ密度は S3 および S0 状態に比べてかなり回復していますが、水域 W1 ～ W4 のオミットマップ密度はまだ同様のレベルに達しておらず、伸びたままです。 500 μs で観察されたのと同様の W1/W2 の重複に注目します。これは、O2 放出によって形成された空いたサイトを再充填する水の結合後の、S3→S0 遷移で起こることが知られている 2 番目のプロトン放出の開始を示している可能性があります 21,24,25。興味深いことに、W3 密度の細長い形状は、W3 の 2 つの可能な位置で以前にモデル化した S0 状態でも持続します (参考文献 4)。

図2eは、両方ともMnとCaの間を架橋するD1-D170およびD1-E189配位子が、O2の形成および放出中にその構造を変化させることを示しています。 W1 および W2 水配位子で観察された高い移動度と一致して、D1-D170 と Ca の間の結合は 730 ～ 2,000 μs の間で弱まるように見え、S0 状態 (3F(200 ms)) でのみ完全に回復します。

1,200 μs から 4,000 μs まで、いくつかの構造変化が発生しますが、安定した S0 状態 (3F(200 ms)) が形成されると元に戻ります。これらには、Yz-D1-H190、Ca-D1-E189、Mn4-O5 の距離の増加、ならびに Mn1-Mn4 および Mn1-Mn3 の距離の減少が含まれます。これらの変化のほとんどは、おそらく O1 チャネルからの Ca イオン 26,27 を介した O2 放出および/または水の挿入を示しています (下記を参照)。これは、O2 の放出とバルク水によるクラスターの再充填、および触媒中心のリセットが長期間にわたって発生することを示しています。

PS II には、OEC からチラコイド膜の内腔側まで延びるいくつかの親水性チャネルがあり 11、28、29、30、31、これらのいくつかは、触媒サイクル中にプロトンと基質水を輸送する際に重要な役割を果たすことが提案されています（ O1、O4、および Cl1 チャネルを図 1)24、32、33 に示します。 S2→S3 転移に関する最近の研究 12 では、OEC の O1 と Ca からバルクに伸びる O1 チャネルを基質水チャネルに割り当て、また、OEC の W1 と W2 から伸びる Cl1 チャネルを割り当てました。バルクへの OEC は、S2→S3 遷移中のプロトン放出チャネルとなります6。 S3→S0 遷移には、1 つの基質水の OEC への挿入と 2 つのプロトンのバルクへの放出も含まれます。 1 つのプロトンは O-O 結合形成前に放出され、もう 1 つは水分子の OEC への再結合後に放出されることが示唆されています 24,25,34。

図 4 は、S3→S0 遷移中の OEC 付近の O1 および Cl1/O4 チャネルの時点データを示しています。 OEC 付近の O1 チャネル内の水分子の電子密度は、2mFobs − DFcalc マップ（図 4a）に示されているように、S2→S3 遷移中に観察されたものと同様に大幅に変化します6。水 W27、W28、および W32 (補足表 1 に水の番号が付けられています) は、W29 (B ファクター約 37) などのより安定した水と比較して、電子密度が低く、B ファクター (約 50 Å2) が高くなります (拡張データ図 3)。 Å2)、特に 1,200 μs で。我々はこれをこれらの水の高い移動性を示すものと解釈し、この領域が分子状酸素の放出後にOECを再充填する基質水の入口として機能する可能性があると仮説を立てています12。したがって、我々は、PS II が S2→S3 および S3→S0 遷移の両方で基質摂取に O1 チャネルを使用することを提案します。 5 つの水のグループ (W26 ～ 30) (参考文献 6 の「水車」) の中で、W26 は遷移全体にわたって高い電子密度を示し、500 μs で実質的に高い電子密度を示します。 W26 は OEC の O1 との水素結合距離内にあるため、この相互作用は、OEC が最後の酸化ステップ (つまり、S4 状態の形成) とそれに続く 4 電子を経て進むときに、クラスター上の電荷のバランスをとるために重要である可能性があります。減少して S0 状態が形成されます。

Cl1 チャネルにも変化が観察されます。 250μsで、D1-E65残基はW40に向かって19°回転し、その結果、D1-E65とW40の間の距離が0.3Å短縮されます（図4b）。これは、Ox 密度が非対称になり始める時点であり、500 μs ではさらに顕著になります (図 2c)。 500μsでは、W1省略マップ密度もD1〜D61およびW19の領域に向かって引き伸ばされます（図4b）。これは、W40 の水素結合距離内にある D1-D61 カルボン酸酸素密度の減少と、側鎖の回転 (25°) による W40 と D1-E65 の間の距離の 0.5 Å の短縮と一致します。その結果、OEC を D1-E65/D2-E312 領域に接続する連続的な水素結合ネットワークが形成されます。この変化は、OEC から Cl1 チャネルへの最初のプロトン移動に関連していると推測されます。これらの変化は 730 μs の時点までに逆転します (図 4b)。初期の脱プロトン化イベントは、異なる方法を使用した他の研究によっても示唆されており、時定数は 50 ～ 300 μs の範囲です (つまり、最後の酸化イベントの前、つまり一時的な S4 状態の形成) 15,16,17,21,24 、34、35。

1,200 μs で、この遷移中に D1-E65 残基が 2 度目に W40 に向かって回転し、これに伴って W42-D1-E65 の距離が 0.4 Å 短縮されます。したがって、500 μs で観察されたものと同様の、OEC から D1-E65/D2-E312 領域への水素結合ネットワークがこの時点で再形成されます。 D1-E65/D2-E312 の距離は約 2.6 Å から約 3.2 Å まで伸びており、これは相互作用が大幅に弱まっていることを示しており、次の陽子を受け入れることができる配置を形成している可能性があります。この変化は、Ox電子密度がオットミマップ（図2）の検出レベルを下回って減少し、O1チャネルでW28、W27、およびW32密度が減少する時間と一致します（図4a）。我々は、この一連の変化が、Mn4CaO5 クラスターの回復プロセスの開始 (つまり、脱プロトン化を伴う OEC への水の挿入によって開始される) に関連していると解釈します。 2,000および4,000μsでは、D1-E65の側鎖はS3構造内の位置からW119に向かってほぼ40°回転します（図4b）。 D1-E65-W119 の距離は約 2.5 Å であり、これら 2 つのグループ間に陽子が共有されているか、または非常に緊密な相互作用があることが示唆されています。 D1-R334 も 20°移動し、W41 と水素結合相互作用を形成します。

D1-E65/D2-E312 領域付近の変化は、S2→S3 遷移中のプロトン放出について観察されたものを思い出させるため、バルクへのプロトン放出を示しています 12。 S3→S0 遷移では、この領域の初期の変化 (250 ～ 730 μs) は最初の陽子移動に関連し、後の変化 (1,200 ～ 4,000 μs) は OEC からの 2 番目の陽子移動に関連していると仮説を立てます。 D1-E65の回転を介してD1-D6136,37を経由してバルクへ。したがって、今回の結果は、D1-E65/D2-E312 領域が S3→S0 遷移中に 2 回プロトン放出のゲートとして機能することを示唆しています。

W20 は、O4 チャネル内の W19 を介して O4 と強固な水素結合ネットワークを形成し、S1→S2 遷移中に消失し、S0 状態で再び現れます 4。したがって、S3→S0 遷移中の復帰は、S0 状態の完全な回復の指標となります。 W20の復帰を示す最初の明確な兆候は、Fobs(4,000μs) − Fobs(2F)の差分マップ(図4bのオレンジ色の濃さ)に見られ、4,000μsの洗練されたコンポーネントの40%の占有率でモデル化されました。これは、W20 の回復が OEC 回復の後期段階で起こることを意味します。

S3→S0 移行中の PS II の構造のスナップショットは、異なる時定数を持つ複数の場所での各イベントのシーケンスと進行を示しています。図 5 に示すように、構造変化は、開始時間と反応速度が異なる 4 つのセクションに大まかに分類できます。それらは、Yz の酸化還元状態の変化、最初の脱プロトン化、OEC の酸化と O2 の形成、そして S0 状態での Kok クロックの完全な回復とリセットです。

最初の脱プロトン化イベント、分子状酸素の放出、水の挿入、および 2 番目の脱プロトン化イベントに至る一連のイベント (i ～ iv)。 OEC 原子は紫 (Mn)、緑 (Ca)、赤 (O) で示されています。 O1 チャネルは赤、O4 チャネルは青、Cl1 チャネルは緑で表示されます。 OEC のリガンドと水 - プロトンチャネルを形成する残基は、それらが属するサブユニットに基づいて色付けされます (D1、青、D2、緑)。プロトン (シアン色の矢印)、水 (赤色の破線の矢印)、酸素 (赤色の実線の矢印)、および電子 (緑色の矢印) の移動に考えられる経路が示されています。注目すべき機能は黒い矢印で強調表示されます。右側の黄褐色のボックスは、O-O 結合形成の推奨モデル (モデル a およびモデル b) を示しています。マゼンタで強調表示された酸素は、O-O 形成の候補原子を示します。

S3 状態では、4 つの Mn はすべて正式には (+IV) 酸化状態になります。 S2→S3転移中のMnの代わりに配位子の酸化（オキシルまたはオキソ-オキシル結合の形成）が文献5で示唆されていることに注意してください5が、これは室温X線発光分光法（XES）とは一致しません。 ) データは、Mn6,13 の酸化を示しています。 3回目のフラッシュでは、反応中心クロロフィルでの電荷分離後、P680+への電子の供与によってYzの酸化が起こります。 3F(50μs)におけるS3状態と比較して、YzとD1-H190との間の距離の増加が観察される(図3および5(i))。この変化は \({{\rm{Y}}}_{{\rm{z}}}^{\mathrm{ox}}\) 形成に割り当てられており、光励起後 30 μs 以内に起こることが知られています 38。および \({{\rm{Y}}}_{{\rm{z}}}^{\mathrm{ox}}\) と D1-H190 の間の関連するプロトン転座。

\({{\rm{Y}}}_{{\rm{z}}}^{\mathrm{ox}}\) の形成は、おそらく 200 ～ 500 μs の期間中に最初の脱プロトン化イベントを引き起こします15,16 、17、24、34、39。我々は、プロトンゲートの一部であると考えられているD1-E65の回転の開始と、250μsでOECからこの領域への水素結合経路の形成を観察した。これらの変化に伴い、W1およびD61の電子密度は500μsでより顕著になり（図2dおよび4b）、これはOECからプロトンゲート残基D1-E65およびD2-E312へのプロトン放出に潜在的に関連している（図2dおよび4b）。 5(ii))。

500 ～ 1,200 μs の期間の初期段階で、最後の酸化イベント (Mn(IV)4O⦁ または Mn(IV)3(V) による一時的な S4 状態の形成) が発生し、続いて Mn の還元が起こります。が起こります（図5(iii)）。 O-O 結合の形成は、OEC のこの最終酸化イベントによって引き起こされ、潜在的に短命な S4 状態になるはずです。 Yz–D1-H190 で 500 ～ 730 μs の間で観測された距離の変化は、\({{\rm{Y}}}_{{\rm{z}}}^{\mathrm{ox} }\) は、この間に OEC から Yz への電子の移動を通じて起こります。 S4 の一時的な形成後、4 電子還元は、O-O 結合の形成と O2 の即時放出を伴う 1 段階で進行するか、OEC から分子状酸素が放出される前に中間体の存在を伴う 2 段階で進行する可能性があります。後者の場合、最初の 2 電子還元によって形成されたペルオキソ種が中間体として現れる可能性が最も高くなります。

私たちのデータは、Yz-D1-H190の距離/回転で示されるO-O結合形成の開始（500-730μs）とOx電子密度の減少およびO2放出の開始の間に遅延があることを示しています。 Mn1 – Mn4 の距離短縮 (1,200 μs) によってサポートされます。この O2 放出の開始時間は、O2 の進化に関する研究とも一致しています 22,40。この遅延は、2 段階の電子還元機構を示す中間状態、おそらく過酸化物のような種が存在することを示しています。

いくつかの O-O 結合形成部位が理論的研究に基づいて文献で提案されています (図 5)3,41,42,43,44,45,46,47,48,49。これらの中で、O5–Ox は、それらが近接していることと、1,200 μs 付近で O5 の占有が減少しているため、データを最も良く説明します (図 5、モデル a)。ただし、O5 が W2 または W3 と反応し、Ox が O5 に置き換わるという 2 つの可能性は、現時点では除外できません (図 5、モデル b)。 O5 が関与しない他のメカニズムを除外することはできませんが、現在のデータではそれらを裏付ける明確な証拠はありません。

1,200 μs では、Ox 省略マップ密度は 2.5σ しきい値を下回っており、Ox の主要な部分がクラスター内の元の位置からシフトしていることを示しています。この時点から始まる Mn1-Mn4 および Mn1-Mn3 の距離の縮小は、O2 放出の開始がこの時期に起こることを示唆しています。 O2 が放出されると、クラスターへの新しい基質水の再充填が直ちに行われるようです。これは、すべての末端水域 (W1 ～ W4) と橋渡し O5 の省略マップ密度が 1,200 μs で弱くなっているにもかかわらず、Ox 以外に欠落している酸素密度はないという観察に基づいています。このデータは、O2 の放出と現場の再充填が高度に調整されていて、既に OEC に接続されている末端水を介して行われる可能性が高いことを裏付けています。

2,000 μs と 4,000 μs の両方で (図 5(iv))、Ox 密度はノイズレベル内にあり、これは Mn1 が主に 5 配位になることを意味します。 Mn4 は 6 配位ですが、Mn4-O5 相互作用は弱い (2.2 ～ 2.3 Å) ため、O5 が水酸化物である可能性が示唆されます。これらの時点では、Ca-D1-E189 距離は S0 状態よりもさらに伸びています。他の遅い回復は、Yz領域（図2b）、「水車」（図4a）、およびプロトンゲート領域（D1-E65 / D2-E312）（図4b）で観察されます。我々は、S2→S3 遷移 6,12 と同様に、O1 チャネルの「水車」領域からの水が OEC の末端水リガンドを置き換えると仮説を立てています。プロトンゲート領域の変化は、新たに挿入された水の脱プロトン化を示している可能性があります36。同時に、アミノ酸調整環境、OEC 周囲の水素結合ネットワーク、および水路内の水が S0 状態にリセットされます。これには、S0→S1 遷移中のプロトン放出に関与すると提案されている O4 チャネルにおける W20 の回収が含まれます 4,50。

今回の研究では、コック時計の最終ステップ（S3→[S4]→S0）までのPS II構造の室温スナップショットにより、光合成による水の酸化の分子プロセスの詳細が明らかになった。これまで、これらのプロセスは主に動力学的研究に基づいて解釈されてきました。重要なのは、ここで報告された結果は、O-O 結合の形成と、おそらく結合過酸化物である一時的な中間体による O2 放出時の Mn4CaO5-Ox クラスターの 2 段階の還元メカニズムの実験的裏付けを提供することです。これは、水の酸化反応の化学を理解するための大きな前進です。この結果は、PS II の OEC などの生物学的触媒が、金属中心、タンパク質環境、水のネットワーク間の相互作用を通じて、多電子/多陽子反応をどのように可能にするのかも示しています。天然酵素における微小環境の積極的な役割は、地球に豊富に存在する元素から作ることができる人工光合成システムにおけるそのような反応を制御する方法にインスピレーションを与えます。

Thermosynechococcus vestitus (以前は Thermosyncechococcus elongatus と命名されていた) の PS II 二量体から調製された 20 ～ 60 µm の結晶の X 線回折測定は、100 mM 2-(N-モルホリノ)エタンスルホン酸、pH 6.5、100 mM 塩化アンモニウム中で行われました。および 35% (wt/vol) PEG 5000 (参考文献 51、52)。約0.5～1.2 mMのクロロフィル（Chl）濃度のPS II結晶懸濁液をシリンジ（ハミルトン気密シリンジ、1 ml）に充填し、データ収集前に1時間暗順応させた。膜入口質量分析法 (MIMS) を使用して、O2 発生、代謝回転パラメーター、および S 状態集団を決定しました 4,6。 XES および電子常磁性共鳴測定に基づくと、PS II 結晶は Mn (II) 汚染を示さず 53、2500 ± 100 μmol O2 (mg(Chl) × h)-1 の活性を示しました。

音響液滴射出54は、ドロップオンテープサンプル送達方法55と組み合わせて使用されました。安定な中間体 S2、S3、および S0 を捕捉するために、結晶懸濁液の各液滴は、Linac コヒーレント光源 ( LCLS)、または 2 つの Nd:YAG (イットリウムアルミニウムガーネット) レーザー (Minilite、Continuum) を組み合わせた 532 nm の 8 ns レーザーパルスにより、Spring-8 オングストロームのコンパクト自由電子レーザー (SACLA) で 3 つのファイバー結合出力を介して使用します。各照射間で 200 ms、最後の照射と X 線プローブ間で 200 ms の遅延時間。これは、アクセプターキノン QA および QB の反応速度論に対応し、S 状態遷移を効率的に駆動するために以前に使用されていたものと同様です。。ベルト速度と堆積遅延のフィードバック制御システムを実装し、それに応じてフラッシング遅延と液滴位相が調整されました55。照明と X 線プローブ間の遅延時間を 200 ミリ秒未満にするために、4 番目の「自由空間」レーザーが使用されました。これは、高分子フェムト秒結晶解析/LCLS 機器の Opolette 355 LD レーザー (Opotek、波長 530 nm、パルス幅 7 ns)、または NT230 OPO レーザーシステム (波長 530 nm、パルス幅 5 ns、EKSPLA Co) のいずれかでした。 .)SACLAにて。この自由空間レーザーは、この研究のために 50 ～ 4,000 μs の間に設定された調整可能な遅延で X 線パルスと同期するようにトリガーされました。レーザーは光学系で X 線相互作用スポットに誘導され、選択した遅延タイミングでレーザースポットの位置がサンプル液滴の位置と一致するように、遅延時間ごとにその位置が微調整されました。 XFEL では、実験で使用したサンプルの寸法と濃度では O2 発生が 70 mJ/cm2 で飽和することが判明したため、120 ± 10 mJ/cm2 の光強度が適用されました4。 1 cm2 あたり 120 mJ の光強度は、結晶の前面の 5 µm 層で PS II モノマーあたり約 140 光子が吸収されることに相当し、結晶の厚さが 60 µm であると仮定すると、PS II モノマーあたり約 9 光子に吸収されます (これは背面の 5 µm 層のサイズは、この研究で使用される結晶のサイズの上限です。この光子密度により、レーザービーム内で 2 つの結晶が重なっている場合でも、結晶体積全体が確実に飽和します。最小パルス長が 5 ns、PS II モノマーあたり 35 Chl であるとすると、使用される光強度は、結晶の前部では平均して 0.8 フォトン/(Chl およびナノ秒)、後部では 0.05 フォトン/(Chl およびナノ秒)となります。 PS II 中心が電荷分離を受けている場合、内部アンテナ Chl によって吸収された追加の光子は、平均蛍光寿命が約 0.5 ～ 1 ns の蛍光の形で急速に散逸されるため、反応中心の過剰励起や加熱の発生が防止されます。工芸品。

結晶学データはさまざまな施設で収集され、詳細は補足表 2 にリストされています。各データセットを収集するために使用された実験ビーム条件と検出器構成も表にまとめられています。サンプルは、前述のドロップオンテープセットアップを使用して X 線相互作用領域に送達されました55。さまざまな S 状態を設定するための照明条件については、参考文献で詳しく説明されています。 4.

さまざまな照明状態に対して収集されたデータは、ターゲット単位セル a = 117.0 Å、b = 221.0 Å、c = 309.0 Å、α = β = γ = 90°、および空間群 P212121 を使用してプログラム dials.stills_process を使用して処理されました。。ブラッグスポットは検出器の端に統合されました。当社のサンプル配送システムのコンベアベルトによるカプトン吸収補正は、液滴サイズ、テープの厚さ、テープの角度、および結晶の位置に対する検出器上の回折スポットの位置を考慮して、統合された各ブラッグスポットに適用されました。。統合の前に、プログラム cctbx.xfel.stripe_experiment を使用して結晶および検出器パラメーターのアンサンブル改良も実行しました。これにより、単位セルの分布が狭まり、最終的な同形差分マップが改善されることが示されています 56。最後に、プログラム cctbx.xfel.merge を使用して強度をマージしました。このプログラムは、イメージごとの解像度カットオフと、参照モデルからの 1% の単位セルしきい値を使用した格子のフィルター処理を適用します。リフレクションをマージするには、参考文献で説明されているベストプラクティスを使用します。 57. 各データセットに結合された単位セルと格子の数は、拡張データテーブル 1 および 2 に表にまとめられています。

最終的に結合されたデータセットは、2F、3F(50 μs)、3F(250 μs)、3F(500 μs)、3F(730 μs)、3F(1,200 μs)、3F(2,000 μs)、3F(4,000 μs)について取得されました。および 3F(200 ms) 状態は 2.16 ～ 2.0 Å の分解能で、6,659 ～ 39,199 格子を結合することで得られます (拡張データ表 1 および 2)。モデル構築前の最終的なマージされたデータセットも、解像度ごとのビンベースで参照データセットにスケーリングされました (この場合、参照データセットは PDB ID コード 7RF1 で公開された PS II データセットです)12。これにより、異なるデータセット間の mFob − DFcalc オミットマップと 2mFob − DFcalc マップのより正確な比較を行うことができます。

各データセットは、プログラム phenix.refine58 を使用し、出発点として以前の研究 (PDB ID コード 7RF1) で公開された高解像度 PS II 構造 (1.89 Å) を使用して精製されました。改良はいくつかの段階で行われます。まず、開始モデルの B 因子が 30 に設定され、すべての水と OEC の原子が削除されます。モデルを単位セルに調整するために、xyz 座標および等方性 B 因子の改良と組み合わせた最初の剛体の改良が 15 サイクル実行されました。次に、OEC 原子が再び追加され、カスタム結合制約を使用して数サイクルにわたって調整されます。また、精製ではクロロフィル a (ポルフィリン環の平面に対して Mg を正しく配置できるようにするため) と未知の脂質様リガンド (ステアリン酸) に対してカスタムの結合拘束を使用します。 OEC + タンパク質複合体の最初の精製後、phenix.refine 水選択プロトコルを使用してモデルに水が追加され、coot59 を介して手動で水が配置され、複数サイクルの精製が行われました。

この段階で、OEC 付近のモデルと OEC 自体 (タンパク質と OEC 原子のみ) を複数のコンポーネントに分割します (拡張データ表 3)。分割は、チェーン A/a、C/c、および D/d の一部でのみ行われました。使用される各時点の構成要素の理論的根拠と母集団については、「各時点での母集団分布の推定」セクションで説明されています。各データセットでは、一次配座異性体 (S3 から S0 に進む中間体として定義) が、逆数 xyz + 等方性 B 因子リファインメントの戦略を使用してリファインされます。二次/三次コンポーネント (その構造は S3 または S0 状態にあることが知られている) の場合、グループ B 因子のみが調整され (phenix.refine の group_adp 戦略)、データセットの解像度に合わせて調整されます。分割されていないモデルの残りの部分では、通常の相互 xyz リファインメントと等方性 B 因子リファインメントが複数のサイクルで並行して実行されます。すべての水（OEC に連結された末端水、つまり W1 ～ W4 を除く）は単一の成分として精製されました。

多成分モデルの主成分における OEC の改良は、S3 状態のモデル化に使用されたカスタム制約を使用して行われました。ただし、すべての時点で、拘束の推定 sd 値を少し緩めに推定し (結合に 0.1 Å、角度に 10°) 使用して、精製中に OEC 原子が電子密度が最適にモデル化される方向に移動し、歪みを低減できるようにしました。クラスターの全体的な形状を維持しながら、同時に洗練されます。 S0 状態の OEC は、以前に公開された S0 状態構造に使用された制約を使用してモデル化されました。時点での OEC 原子をモデル化するために使用される制約は、テキストファイルとして提供されています (補足データのスキーム 1 ～ 3)。

S3→S0 遷移における S 状態の人口分布は、(1) S3 状態から S0 状態に進む中心、(2) 1 回の遷移が遅れているために S3 状態から S0 状態から進む中心、からなる不均一な分布です。 S2 から S3 ステート、および (3) S0 ステートに移行したセンター。大部分のセンターはカテゴリー (1) に属しますが、PS II20 のコックサイクルの本質的な非効率性 (「ミス」) により、センターの一定割合はカテゴリー (2) に属します。さらに、S3 から S0 への移行で一定時間が経過すると、かなりの数の中心が安定した S0 状態を形成します (カテゴリー (3))。

この状況を考慮すると、正確な電子密度マップとモデルを取得するには、構造モデリングでこの集団の不均一性を考慮することが重要です。これを行うには、活性部位領域 (OEC を含む) 付近の構造モデルを複数のコンポーネントに分割します。各データセットの主コンポーネントはカテゴリ (1) であり、S3 から S0 への中間遷移です。二次および三次コンポーネントの性質は、検討中のデータセットによって異なります。各データセットでは、主成分のみの座標/等方性 B 因子が洗練されます (カテゴリ (1))。二次および三次コンポーネントの構造は、既知の構造または以前に堆積された構造からモデル化され、グループ B 因子の改良を使用して解像度のみ調整されます。 2 次 (使用する場合は 3 次) コンポーネントの ID は、どの時点が処理されるかによって異なります。たとえば、3F(50 μs) データセットでは、2 成分モデルが 2F(50 μs) モデル座標/B 因子を二次成分に使用して構築されます。 3F(1,200 µs) データでは、2 次成分と 3 次成分が S0 状態と S3 状態である 3 成分モデルを使用します。さまざまな時点における各成分の個体数を拡張データ表 3 に示します。文献で入手可能な数値を使用して動態解析を実行し、個体数分布の推定値を算出しました。 10% 未満の集団は構造精製のノイズレベルにあるため、そのような低い集団を持つ配座異性体を避けるように集団を調整しました。

それぞれの準安定 S 状態の人口分布は、MIMS 技術を使用して事前に決定されています。私たちの研究では、結晶で行われた研究に基づいて、2 つの可視レーザーを 200 ms のフラッシュ間隔で照射することによって生成される開始 2F 状態は、約 65% の S3 状態と 35% の S2 状態で構成されます。 3 回目の目に見えるフラッシュにより、S3→S0 への移行が開始されます。リーダーは参考文献の拡張データを参照します。 XES および MIMS データから計算されたミスパラメータ、およびクロスイルミネーションを考慮して、各フラッシュ状態の S 状態個体数がどのように推定されたかについての詳細は、4 を参照してください (これは、テープの速度と音響液滴の堆積周波数では無視できました)本研究で使用された排出）。この論文に記載されている結果はすべてモノマー I (公開された構造では大文字で注釈が付けられている鎖) からのものです。同様の傾向がモノマー II (小文字で注釈が付けられた鎖) でも観察されます。

Mn1 – Mn4 距離は、S3→S0 遷移が起こる中間部の 3F(1,200 µs) まで伸長したままであり、その後、次の 3 ms で減少が見られます。我々は、この観察を説明する代替仮説を構築することにより、3F(1,200 μs) での延長距離のロバスト性をテストしました。この仮説は、主成分の 2 つの異なる母集団によるものである可能性があると仮定します。 (1) ミスによる Mn1 – Mn4 距離の増加追加のS3を形成する、または（2）S3→S0転移を受ける中間体の特性であるMn1-Mn4距離の減少（Oxの消失の有無にかかわらず）。 3F(1,200 μs) の時点で、S3 母集団を 35 から 55% に増加させ、主成分 (Ox あり/なし) を 40 % から 20% に減少させることで、このシナリオをモデル化しました。得られた精製により、Mn1-Mn4 の距離は 5.14 Å (Ox あり) および 5.09 Å (Ox なし) となりました。どちらの数値も図 3 に示す距離と同様であり、測定誤差の範囲内です。したがって、テストでは S3 状態と比較して収縮が示されず、仮説を棄却することができます。 3F(1,200 μs) 時点での S3 個体数推定値 35% は、前のセクションおよび過去の出版物で詳述したように、複数の独立した実験を使用して十分に確立されていることを繰り返します。

各時点の OEC 原子と周囲のアミノ酸の位置精度を推定するために、以前に使用されたものと同様の END/RAPID 手順 60 を使用しました 6。簡単に言うと、この方法では、±(mFob − DFcalc) の間のランダムな量で構造因子を摂動させます。その時点の最終モデルの原子座標も少量で摂動され、モデルがより広い位相空間を探索できるようになります (摂動されるのは一次配座異性体のみです)。その後、各時点でそのような合成データセットが 100 個生成され、それぞれが個別に洗練されます。これらの洗練されたデータセットのアンサンブルから、対象の距離メトリックに関連する誤差を推定できます。構造因子に導入された摂動は実験における真の誤差を過大評価しているため、得られた誤差は上限と見なす必要があります。

実装の詳細については、https://bl831.als.lbl.gov/END/RAPID/end.rapid/Documentation/end.rapid.Manual.htm を参照してください。

原稿に示されているすべての mFob − DFcalc オットミマップは、phenix.polder プログラムを使用し、output.mtz ファイルからの通常のオミットマップ係数 (ポルダーマップ係数ではない) を使用して生成されました61。ピーク高さの計算には、特に記載がある場合は常に、対象の原子の半径約 0.5 Å の mFob − DFcalc 省略マップ値を平均するカスタム Python スクリプトを使用しました。

研究デザインの詳細については、この記事にリンクされている Nature Portfolio Reporting Summary を参照してください。

原子座標と構造因子は、タンパク質データバンク、www.pdb.org に寄託されています (PDB コードは、2F データは 8EZ5、3F(50 μs) データは 8F4D、3F(250 μs) データは 8F4E、8F4F です。 3F(500μs)データの場合、8F4G 3F(730μs)データの場合、8F4H、3F(1,200μs)データの場合、8F4I、3F(4,000μs)データの場合、8F4J、8F4K 3F(200ms)データの場合は8F4C、2Fオルタネートデータの場合は8F4C)。生の X 線自由電子レーザーデータは、Coherent X 線イメージングデータベース、www.cxidb.org (ID 215) に保管されています。

オープンソースプログラムの dials.stills_process、cctbx.xfel GUI、cctbx.xfel. Stripe_experiment、cctbx.xfel.merge、およびレガシープログラム cxi.merge は、http://dials.github.io で入手できる DIALS パッケージとともに配布されます。これらのプログラムの使用手順と詳細については、参考文献を参照してください。詳細なドキュメントは http://cci.lbl.gov/xfel で入手できます。論文に示されている図は、PyMOL ソフトウェア v.2.5 (参考文献 62) を使用してレンダリングされました。ピーク高さの値を計算するために使用されるカスタムコードは、https://github.com/asmit3/eden (参照 63) で公開されています。

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Bhowmick A. asmit3/eden: リリース v.0.1.1。ゼノド https://doi.org/10.5281/zenodo.7734707 (2023)。

リファレンスをダウンロードする

この研究に興味を持ち、光合成水の酸化について多くの議論をしてくださった K. Sauer (1931–2022) に感謝します。 R. Massad、M. Kretzschmar、P. Sinnott、J. Blaschke、A. Britz、S. Carbajo、C. de Lichtenberg、L.-C. に感謝します。 Kao、L. Lassalle、D. Liebschner、D. Mendez、F. Moss、E. Pastor、C. Pham、B. Poon、KD Sutherlin、ID Young がサンプル調製、データ収集、処理中のサポートに協力してくれました。 LCLS/SLAC、SACLA/Japan、SSRL、ALS のサポートスタッフに感謝します。この研究は、エネルギー省 (DOE) の化学科学、地球科学、生物科学部門、基礎エネルギー科学局 (OBES) 科学局局長 (JY、VKY および JK) の X 線分光分析の支援を受けました。結晶学データの収集と分析、および光合成システムの手法開発は国立衛生研究所 (NIH) によって支援されました。光化学系 II 生化学には GM055302 (VKY)、X 線の機器開発には GM110501 (JY) および GM126289 (JK) が助成されています。自由電子レーザー (XFEL) 実験および XFEL データの計算プロトコルの開発のための GM117126 (NKS))。 NKS は、DOE 科学局と国家核安全保障局の共同取り組みであるエクサスケールコンピューティングプロジェクト (助成金 17-SC20-SC) からの支援に感謝します。ドイツのエクセレンス戦略 (プロジェクト EXC 2008/1-390540038 (AZ、HD および SH)) は、共同研究センター SFB1078 (ベルリンのフンボルト大学)、TP A5 (AZ、HD、MI、 RH および JG)、Vetenskapsrådet (助成金 2016-05183 (JM) および 2020-03809 (JM))、および Energimyndigheten (助成金 45421-1 (JM)) のサポートが認められています。 RH は、ベルリンフンボルト大学のキャロラインフォンフンボルト奨学金からの支援に感謝します。 CJK は、NIH からの支援を認めています (NRSA フェローシップ賞 F32GM142218)。この研究は、エネルギー省科学局によって支援されるユーザー施設である NERSC のリソースを使用しました (契約 DE-AC02-05CH11231)。 XFEL データは、スタンフォード大学の LCLS/SLAC および日本の SACLA で収集されました。 SACLAでのXFEL実験は、高輝度光科学研究センターの承認を得てBL2で実施されました（提案書2018B8089、2019A8081、2019B8067）。結晶と装置のさまざまな部分のテストは、バークレーの ALS とスタンフォードの SSRL が提供し、DOE OBES の資金提供を受けて提供されたシンクロトロン施設で実施されました。 SSRL 構造分子生物学プログラムは、DOE OBER および NIH によって支援されています (助成金 P41GM103393)。 LCLS および SSRL の使用、SLAC 国立加速器研究所は DOE、科学局、OBES (契約 DE-AC02-76SF00515) によってサポートされており、LCLS での構造生物学の研究は NIH (助成金 P41GM139687、Rayonix 検出器) によってサポートされています。助成金 S10 OD023453 によって資金提供されました)。

モハメド・イブラヒム

現在の住所: リューベック大学分子医学研究所、リューベック、ドイツ

これらの著者は同様に貢献しました: Asmit Bhowmick、Rana Hussein、Isabel Bogacz、Philipp S. Simon

米国カリフォルニア州バークレーのローレンス・バークレー国立研究所、分子生物物理学および統合バイオイメージング部門

アスミット・ボーミック、イザベル・ボガッチ、フィリップ・S・サイモン、ルチラ・チャタジー、マーガレット・D・ドイル、キム・インシク、マキタヒロキ、メダンジャリ・ダスグプタ、コーリー・J・カミンスキー、ミャオ・チャン、イザベラ・I・ナンカ、スティーブン・M・キーブル、ジェームズ・M .ホルトン、ダニエル・W・ペイリー、ナイジェル・W・モリアーティ、ポール・D・アダムス、アーロン・S・ブリュースター、ニコラス・K・ザウター、ヤン・カーン、矢野純子、ヴィタル・K・ヤチャンドラ

ベルリン・フンボルト大学生物学部、ベルリン、ドイツ

ラナ・フセイン、モハメド・イブラヒム、ユリア・ゲッケ、ステファニー・ハウプト、ホルガー・ドベック、アティナ・ズーニ

分子生体模倣学、化学科 — Ångström、ウプサラ大学、ウプサラ、スウェーデン

ムン・ホン・チア, ペトコ・チェルネフ, A. オルクン・アイディン, フィクレット・マメドフ & ヨハネス・メッシンガー

KTH王立工科大学、ストックホルム、スウェーデンの理論化学生物学部

トーマス・フランソン

高輝度光科学研究センター、兵庫県

Kensuke Tono & Shigeki Owada

理化学研究所スプリングエイトセンター（兵庫県）

Kensuke Tono & Shigeki Owada

リニアックコヒーレント光源、SLAC 国立加速器研究所、メンローパーク、カリフォルニア州、米国

リーランド・B・ジー、フランクリン・D・フラー、アレクサンダー・バチューク、ロベルト・アロンソ・モリ

カリフォルニア大学、サンフランシスコ、米国カリフォルニア州生化学および生物物理学科

ジェームス・M・ホルトン

SSRL、SLAC 国立加速器研究所、メンローパーク、カリフォルニア州、米国

ジェームス・M・ホルトン

カリフォルニア大学バイオエンジニアリング学部、バークレー、カリフォルニア州、米国

ポール・D・アダムス

ウィスコンシン大学マディソン校物理学科、米国ウィスコンシン州マディソン

ウーヴェ・ベルクマン

ウメオ大学化学科、ウメオ、スウェーデン

ヨハネス・メッシンガー

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RA-.M.、NKS、UB、AZ、JM、JK、JY、VKY が実験を設計しました。 RH、MI、RC、MD、MZ、JG、SH、IIN、AZ、JK のサンプルを準備しました。 RC、MHC、TF、JG、SH、AOA、FM はサンプルの活性を特徴付けました。 KT、SO、LBG、FDF、A.バチュク、RA-.M。 X線自由電子レーザー（XFEL）ビームラインを準備し、運用しました。 IB、PSS、PC、I.-SK、HM、FDF、JK がサンプル配信システムを開発、テスト、実行しました。 A.ボーミック、RH、IB、PSS、MI、RC、MDD、MHC、TF、PC、I.-SK、HM、MD、CJK、MZ、JG、SH、SMK、KT、SO、LBG、FDF、A .Batyuk、RA-.M.、DWP、ASB、NKS、UB、AZ、JM、JK、JY、VKY が XFEL 実験を実施しました。 A.Bhowmick、JMH、DWP、NWM、PDA、ASB、NKS はデータ処理用の新しいソフトウェアを開発しました。 A.Bhowmick、MD、SMK、DWP、ASB、NKS が XFEL データを処理しました。 A.Bhowmick、RH、IB、PSS、MI、MDD、HD、NKS、AZ、JM、JK、JY、VKY がデータを分析および解釈しました。 A.Bhowmick、RH、IB、PSS、MDD、AZ、JM、JK、VKY、JY が、すべての著者からの意見をもとに原稿を執筆しました。

アティナ・ズーニ、ヨハネス・メッシンガー、矢野純子、ヴィタル・K・ヤチャンドラとの通信。

著者らは競合する利害関係を宣言していません。

Nature は、この研究の査読に貢献してくれた Richard Neutze 氏、Dimitrios Pantazis 氏、およびその他の匿名の査読者に感謝します。

発行者注記 Springer Nature は、発行された地図および所属機関の管轄権の主張に関して中立を保っています。

ピーク高さレベルの比較のために、酸素原子 O2 の省略マップも示します。各原子の省略マップは、各データセットの一次配座異性体の原子のみを個別に省略することによって生成されました。マップは 2.5、3、および 4σ の等高線レベルで表示されます。 (a) OX、O5、および O2 のマップを省略します。 (b) W1、W2、W3、W4、および O2 のマップを省略します。 OX、O5、W1、W2、W3、W4 の省略マップのピーク高さの明らかな減少が、730 ～ 2000 µs の間の基準 O2 省略マップと比較して観察されます。

マップは等高線レベル 2.5σ (黄色) で表示されます。電子密度は W3 と W4 の間のこのレベルで観察され (赤い矢印を参照)、おそらく一時的な水の動きを示しており、これは省略マップ密度の重なりによっても裏付けられています。比較のために、W3 と W4 の個々の省略マップも 2.5、3、4 σ で重ね合わせます (配色は本文の図 2 と同じ)。図 2 に関連する本文で説明したように、おそらくプロトン移動を伴う運動に関連している可能性がある W1/D61 付近でも、より強い電子密度が観察されています。O1 付近の電子密度は、W26 ～ W30 で観察された変化に関連している可能性があります (この時点での「水車」領域）（図 4 に関連する本文で説明）。

すべての流路水の B 因子分布は、比較のために各時点で重ねられます。 4 つの水域のマーカーポイントの Y 軸の値は単なるプレースホルダーです。 OX の消失と一致する 3F (1200 μs) の時点では、W27、W28、および W32 の相対 B 因子値に大きな変化が見られます。

補足表 1 および 2。

この zip フォルダーには、補足スキーム 1 ～ 3: S3→S0 遷移における OEC のモデル化に使用される制約が含まれています。

S3→S0 移行における OEC でのさまざまな変化を示すビデオ。高解像度バージョンは https://drive.google.com/file/d/1d4fMKBcYUdenqajlXo3J-a8lU5eaUxe3/view?usp=share_link から入手できます。

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転載と許可

Bhowmick、A.、Hussein、R.、Bogacz、I. 他。光化学系 II における O2 形成中の中間体の構造的証拠。ネイチャー 617、629–636 (2023)。 https://doi.org/10.1038/s41586-023-06038-z

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受信日: 2022 年 11 月 18 日

受理日: 2023 年 3 月 31 日

公開日: 2023 年 5 月 3 日

発行日: 2023 年 5 月 18 日

DOI: https://doi.org/10.1038/s41586-023-06038-z

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